Аннотация
Протеазы являются ферментами, гидролизующими белки по пептидным связям, и классифицируются на семейства сериновых, цистеиновых, аспартатных и металлопротеаз. Протеазы, в особенности, микробиального происхождения используются в различных отраслях человеческой деятельности. Штаммы-продуценты бациллярных протеаз способны расти на недорогих питательных средах, что имеет немаловажное значение для индустрии. Целью работы являлось получение рекомбинантных металлопротеаз М14 и М42 бацилярного происхождения и изучение их свойств. На основании последовательности генома штамма Bacillus paralicheniformis (GenBank NCBI под номером доступа CP124861) подобраны праймеры для клонирования генов металлопротеаз М14 и М42 с молекулярными массами 60,6 кДа и 38,2 кДа, соответственно. Гены были клонированы в составе бактериального экспрессионного вектора рЕТ-28с(+) по сайтам BamHI и XhoI и встроены под контроль промотора Т7. Биоинформатический анализ показал, что металлопротеаза М14 содержит сигнальный пептид MNIQKRVQALLAAAAMFAGLMVSDAVHA, который был удален при клонировании. Путем плазмидной экспрессии в штамме Escherichia coli ArcticExpress(DE3)RP получены рекомбинантные белки rМ14 и rМ42. Индукцию для гетерологичной экспрессии осуществляли путем добавления 0,5 мМ изопропил-β-тиогалактопиранозида. Очистку rМ14 и rМ42 из бактериального лизата осуществляли методом металлоаффинной хроматографии с использованием Ni-NTA сорбента. Очищенный рекомбинантные белки были диализованы на мембране с порогом отсечения 14 кДа. Выход рекомбинантных белков rМ14 и rМ42 составил 27,5 мг и 1,67 мг с 1 литра индуцированной культуры, соответственно. Изучение биохимических свойств показало, что металлопротеазы rМ14 и rМ42 активны при 50°С в буфере Tris-HCl с рН 7,0. Зимографический анализ на казеине, сополимеризованным с полиакриламидным гелем подтвердил протеолитическую активность rМ14 и rМ42. Полученными рекомбинантными белками были иммунизированы кролики. Иммунизацию проводили в течение 1 месяца. После подтверждения иммунного ответа, была получена сыворотка, из которой были выделены антитела анти-rM14 и анти-rM42 путем высаливания сульфатом аммония с последующим диализом. С помощью данных антител методом вестерн-блоттинга была проверена секреция металлопротеаз М14 и М42 в энзиматическом экстракте, полученном путем культивирования нативного штамма Bacillus paralicheniformis на перьевой среде. Установлено, что в энзиматическом экстракте штамма Bacillus paralicheniformis присутствует металлопротеаза М14 и отсутствует М42, что можно объяснить определяющей ролью сигнального пептида. В дальнейшем будет продолжено изучение металлопротеаз rМ14 и rМ42, а полученные антитела rM14 и анти-rM42 будут использованы для определения уровня накопления нативных металлопротеаз в секреторной и внутриклеточной протеоме протеолитических штаммов рода Bacillus при их культивировании на различных субстратах.